Проучившись несколько лет в школе, Роберт в 16 лет бросил ее и поступил в Высшую школу актерского мастерства в Нью-Йорке, а также окончил курсы Стелы Адлер и Актерскую студию Ли Страсберга. Наследники классической школы мастерства Станиславского, они привили эту приверженность и молодому актеру. Впоследствии он тщательно входил в каждую из ролей задолго до съемок.
В 1963 году Де Ниро впервые попал на съемочную площадку, его дебют должен был состояться в фильме «Свадебная вечеринка», но картина вышла на экраны лишь через 6 лет. Первый фильм с участием Роберта вышел в 1965 году — он сыграл эпизодическую роль в фильме «Три комнаты на Манхэттене». Затем Де Ниро продолжил сниматься, однако это были эпизодические роли.
Первый успех пришел к актеру в 1973 году, когда за второстепенную роль в фильме «Бей в барабан медленно» он получил награду Нью-Йоркской гильдии кинокритиков, а с ней и известность. В этом же году актер снялся в картине «Злые улицы» режиссера Мартина Скорсезе. Эта роль стала подлинным открытием Де Ниро, как актера, за нее он получил премию Национального совета кинокритиков США. Еще эта работа стала началом тесной дружбы и творческого союза Де Ниро и Скорсезе, который снял актера во многих своих картинах. Именно в фильмах этого режиссера талант Роберта раскрылся в полной мере.
В 1974 году Коппола пригласил его в свой фильм «Крестный отец II», роль в котором принесла Де Ниро грандиозный успех и первый «Оскар» (лучший актер второго плана). Затем одна за другой последовали роли, имевшие признание, и у критиков, и у зрителей: «Таксист» (1976), «Нью-Йорк, Нью-Йорк» (1977), «Охотник на оленей» (1978) и многие другие. Все эти работы получали или номинировались на самые престижные кинематографические премии. В 1980 году на экраны вышел фильм Скорсезе «Бешеный бык», за роль в котором актер получил свой второй «Оскар», уже за главную роль.
Актерская карьера Де Ниро успешно развивалась, каждый год выходило по нескольку фильмов с его участием, где созданные актером образы были яркими и запоминающимися, – «Король комедии» (1983), «Однажды в Америке» (1984), «Славные парни» (1990), «Мыс страха» (1991) и многие другие. Известность актера была настолько высока, что его имя и талант приносили успех любой, даже самой заурядной картине.
Начало 1990-х годов ознаменовалось для актера творческим спадом. Но он смог реабилитироваться и великолепно сыграть в картинах «Казино», «Схватка» (1995), «Анализируй Это» (1999) и «Знакомство с родителями» (2000). Кроме того, он в очередной раз показал способность играть и более тонкие человечные роли — в картинах «Спящие» и «Комната Марвина» (1996).
Помимо актерской деятельности, Де Ниро пробовал себя и в режиссуре, где его дебютом стала картина «Бронкская история» в 1993 году, в которой он исполнил главную роль. В 2006 году на экраны вышла еще одна его работа – шпионская драма «Ложное искушение». Также он выступал и как продюсер многих фильмов, в которых снимался, еще с 1989 года.
В новом тысячелетии актер продолжает активно работать. Среди его работ – роли в картинах: «Военный ныряльщик» (2000), «Медвежатник» (2001), «Знакомство с Факерами» (2004), «Артур и минипуты» (2006), «Право на убийство» (2008), «Профессионал», «Старый Новый год», «Области тьмы» (2011), «Последний мальчишник в Вегасе» (2013), «Малавита» (2013), «Стажёр» (2015), «Дедушка лёгкого поведения» (2016), «Джокер» (2019), «Ирландец» (2019), «Дедушка НЕлёгкого поведения» (2020), «Афера по-голливудски» (2020) и другие. Вообще, за свою карьеру в кино Де Ниро исполнил около сотни ролей и не собирается останавливаться на достигнутом, фильмы с его участием анонсированы на несколько лет вперед.
В дополнение к своей актерской работе, Де Ниро успешен и в бизнесе. Значительную часть своих средств он инвестирует в различные предприятия, являясь их совладельцем. Самые известные из них — всемирная сеть ресторанов Nobu, компания Nobu Hospitality и ресторан «Рубикон» в Сан-Франциско. Еще он активно занимается благотворительностью.
Актер был дважды женат и у него пятеро детей.