В 1943-1947 годах работал слесарем на заводе «Красная Этна» в Горьком. В 1951 году окончил Горьковское театральное училище (Нижегородское театральное училище с 2003 года носит его имя) и до 1954 года был актером Владимирского областного драматического театра. В 1956 году окончил Школу-студию МХАТ, затем стал актером этого театра.
В 1957-1970 годах выступал на сцене «Современника», специализируясь на ролях с отрицательным обаянием, острой характерностью, подчас с сатирической направленностью. Но не оставался строго в рамках амплуа, сыграв Чернышева в «Декабристах», Александра II в «Народовольцах», Сатина в «На дне».
Сниматься в кино Евстигнеев начал еще в 1957 году («Поединок»), преимущественно в небольших ролях. Его герои – всевозможные чиновники, служащие и прочие работники умственного труда. Таковы Дынин («Добро пожаловать, или Посторонним вход воспрещен», 1964), режиссер драмколлектива («Берегись автомобиля») и Миша («Крылья») – 1966, Огородников («Старшая сестра», 1967), Калачев («Зигзаг удачи») и Корейко («Золотой теленок») – 1968.
Евстигнеевские образы становятся более заостренными, язвительно развенчиваемыми, порой доведенными до фарсово-абсурдного воплощения и приобретающими зловещий оттенок в фильмах: «Гиперболоид инженера Гарина» (роль Гарина, 1966), «Скверный анекдот» (генерал Пралинский, 1966, выпуск на экран – 1988), «Бег» (Корзухин, 1971).
Он стремился внести элементы лиризма и трогательности в неуживчивые характеры персонажей. Таковы его герои в картинах: «Верность» (1965), «Старики-разбойники» (1972), «Семнадцать мгновений весны» (1973), «Повесть о неизвестном актере» и «Подранки» (1977), «Старый Новый год» (1980), «Еще люблю, еще надеюсь...», «И жизнь, и слезы, и любовь» (1984), «Зимний вечер в Гаграх» (1986) и незабываемый профессор Преображенский («Собачье сердце», 1988).
Евстигнеев до последних дней продолжал много сниматься и играть на сцене МХАТа, куда он ушел вслед за Ефремовым еще в 1971 году. И много еще хотел сыграть...
Евгений Александрович Евстигнеев умер 4 марта 1992 года в Лондоне, куда приехал, чтобы сделать операцию на сердце, но не успел. Он был похоронен на Новодевичьем кладбище в Москве.